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正确认证酶标分析的使用与测定波长

时间:2021-06-08 09:52 点击次数:
     作为微孔板酶标分析仪,其基本功能无非是比色测量。差异在于测量波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、振动盘功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面的差异,当然,自动酶免疫分析系统还具有自动洗盘、孵育和加样功能。在临床实验室的实际工作中,当实验人员使用酶标分析仪进行测量操作时,有时难免会对酶标检测仪的一些性能指标产生困惑,甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。如使用酶标仪比较肉眼观察阳性率等问题。下面就酶标仪的测定波长给大家介绍下。

    酶标仪的检测波长一般在400~750nm或800nm之间,完全可以满足ELISA的颜色测定。目前国内常用的ELISA试剂盒标记酶为辣根过氧化物酶(辣根过氧化物酶HRP),底物多为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)。在氢溶液存在下,HRP将其氧化为2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和二酚醌。当pH值为5.0左右时,DAB在450nm波长处吸收最大。当pH值降至L 0时,最大吸收波长移至492 nm。同时,摩尔消光系数变大,显色加深,所以常用硫酸等强酸。或者用盐酸来停止反应。TMB的氧化产物二苯醌在450nm波长处的消光系数最大。如果HRP的量小,H:O:和TMB的量过多,就会形成蓝色阳离子。降低pH值可以将蓝色的阳离子自由基转化为黄色的二苯醌。用硫酸作终止剂可使产物稳定90分钟。因此,450nm和492nm是目前最常用的ELISA检测波长。各种微孔板读卡器均配有可自动切换的过滤器放置部件,可同时安装6 - 8个过滤器。所配置的滤波器应包括上述两个波长。490nm滤光片取代了492nm滤光片,效果不大。除了这两种基本滤光片外,考虑到双波长比色法的需要,还应该有波长为620nm或630nm或650nm和405nm的滤光片。其他过滤器可根据您的需要选择。有时,一些实验室想使用酶标板阅读器进行微量生化测定,因此酶标板阅读器制造商将紫外检测功能扩展到其酶标板阅读器,此时需要一个340 nm波长的滤光片。此时酶标仪的测量波长范围为340-750nm或800nm。

    酶标板阅读器具有单波长和双波长检测功能。有时用户不知道在什么情况下使用单波长或双波长检测。所谓“单波长”,就是用最大吸收波长进行显色,即450 nm或492 nm进行比色测定;而“双波长”是用吸收最大的波长进行显色,即450 nm或492 nm。除了在nm处进行比色测量外,测量还在对特定显色不敏感的波长进行,如630 nm。酶标仪印出的吸光度是两者之间的区别。在630 nm波长处获得的吸光度是非特异性的,来自于平板对指纹、灰尘、污物等的吸收。因此,在ELISA比色法测定中,最好采用双波长,不需要建立空白孔。

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